COLTIVAZIONE FUNGHI: PRODUZIONE DI "SEMI" (SPAWN)

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Il termine “seme” è comunemente utilizzato dai coltivatori di funghi e deriva dall’inglese “spawn” Questo viene utilizzato per inoculare il substrato finale. Lo scopo dello “spawn” è quello di aumentare la biomassa fungina, precedentemente presente come una piccola massa di cellule in una piastra di Petri piuttosto che in una coltura liquida, e di espandere questa massa fino ad ottenere possibilmente diversi chilogrammi di funghi.

Il seme è generalmente costituito da chicchi di cereali come orzo, frumento, segale, avena, riso, ecc., colonizzati dal fungo. Ogni chicco colonizzato, mescolato nel substrato finale, diventa un punto in cui si svilupperà il fungo, colonizzando completamente il sacco o contenitore contenente il substrato in pochi giorni.

Per sterilizzare un grammo di cereali, qualsiasi esso sia, dobbiamo eliminare un numero elevato di possibili contaminazioni. Subito dopo l’idratazione dei chicchi, questi microrganismi iniziano a proliferare molto rapidamente. Tra tutti questi microrganismi presenti nei chicchi, i batteri sono i più veloci. I batteri possono moltiplicarsi in media ogni 20 minuti a temperatura ambiente. Con un simile ritmo, un singolo batterio può moltiplicarsi in più di un milione di cellule in poche ore.

Se solo una piccola parte di questi microrganismi contaminanti sopravvive al processo di sterilizzazione, il risultato può essere devastante, rendendo il “seme” inutilizzabile e vettore di contaminazione anche per gli altri lotti presenti.

Una volta sterilizzato, si presume che il chicco del cereale impiegato sia completamente privo di microrganismi. Anche l’aria è piena di microrganismi sospesi e spore, l’utilizzo di filtri HEPA permette di ridurre drasticamente la loro presenza nell’ambiente di lavoro.

Pertanto, dopo la sterilizzazione, i contenitori o le buste contenenti il substrato finale devono essere mossi in un luogo pulito o devono rimanere nella pentola a pressione/autoclave fino al momento in cui si intende utilizzarli.

La quantità d’acqua aggiunta ai chicchi è un’altro fattore importante. Un eccesso d’acqua favorisce la crescita dei batteri, oltre a rallentare la velocità di crescita del micelio del fungo. Quando l’idratazione dei chicchi supera la soglia, solitamente scoppiano, esponendo il nocciolo del chicco. Anche questo favorisce lo sviluppo dei batteri.

Determinare il corretto punto di idratazione dei cereali che utilizziamo non è un compito difficile, a seconda del cereale utilizzato ci sono delle linee guida da poter seguire, con un minimo di esperienza ci si arriva tranquillamente. Si immergono i chicchi in acqua bollente in una pentola per un determinato tempo fino a raggiungere il corretto punto di idratazione, quindi li si scola.

Dopo il raffreddamento e l’essiccazione all’esterno, i chicchi vengono posti in barattoli di vetro, contenitori o sacchi di polipropilene, solitamente con dei filtri in acrilico o di cotone.

I coltivatori dovrebbero regolare il contenuto di umidità e il tempo di sterilizzazione in base a test e osservazioni. Un fattore molto importante quando si crea il proprio “spawn” è il filtro dell’aria del contenitore. Durante la colonizzazione dei chicchi il micelio ha bisogno di respirare, per questo è necessario avere un filtro dell’aria che impedisca l’ingresso di contaminanti, ma al tempo stesso faccia uscire l’anidride carbonica prodotta dal micelio.

Alcuni coltivatori usano un doppio strato di nastro micro poroso come filtro, piuttosto che del cotone idrofobo o delle porzioni derivanti da filtri per il caffè. È anche possibile reperire sacchetti di plastica resistenti al calore prodotti appositamente per la coltivazione di funghi con un filtro incorporato nella plastica; questo sempre per consentire un adeguato ricambio d’aria durante lo sviluppo del micelio.

Un semplice metodo per realizzare un recipiente adatto per crescere il “seme” è quello di utilizzare vasetti di vetro come quelli delle marmellate per intenderci. Il coperchio viene forato e il filtro apposto sotto il tappo. C’è anche la possibilità di fare un ingresso dove l’ago inietterà la coltura liquida, in modo da ridurre al minimo le possibilità di contaminazione. Basta praticare un foro con un chiodo nel coperchio della barattolo e applicare una goccia di silicone termico resiste alle alle alte temperature durante la sterilizzazione. Questa porta d’ingresso per l’ago in silicone si chiude automaticamente subito dopo la rimozione dell’ago, riducendo la possibilità di contaminazione al minimo.

Ci sono molti modi per realizzare contenitori adatti alla produzione del “seme”, così come diversi sono i fornitori di contenitori specifici disponibili in commercio. L’importante è che il recipiente scelto possa essere sigillato, resista le alte temperature e abbia un filtro che permetta l’uscita del Co2 senza consentire agli agenti contaminanti di entrare.

Dopo aver preparato il substrato e i contenitori, possiamo riempire i barattoli. Sempre nel caso utilizzassimo dei barattoli piuttosto che delle buste, dobbiamo coprirne il coperchio con un doppio pezzo di carta stagnola in modo che l’acqua che condensa all’interno della pentola a pressione dove li sterilizziamo, non entri nei barattoli attraverso i fori del filtro dell’aria.

Il prossimo il passo è la sterilizzazione. Fino a questo punto il materiale utilizzato non necessitava di alcun tipo di pulizia o trattamento. Abbiamo solo preparato i barattoli, messo un filtro, idratato i chicchi di cereali e riempito gli stessi contenitori.

I barattoli o le buste che siano, possono essere sterilizzate in pentola a pressione o in autoclave. Per quanto riguarda la sterilizzazione, le tempistiche variano a in base al volume del materiale da sterilizzare. Contenitori di piccole dimensioni volumi di chicchi devono essere sterilizzati in pentola a pressione per 45 – 90 minuti. Buste di volume maggiore richiedono tempistiche maggiori anche oltre le 2-3 ore.

Per maggiori dettagli sulla sterilizzazione, consulta l’articolo “Nozioni di base sulla sterilizzazione“.

Dopo la sterilizzazione e il raffreddamento possiamo introdurre il micelio aggiungendo pezzi di terreno già colonizzato o tramite una coltura liquida. Per inoculare i vasi con la coltura liquida è necessario che l’inoculo avvenga in un luogo privo di contaminazioni.

Solitamente in un laboratorio, questa procedura viene eseguita in una cappa a flusso laminare, dove l’aria viene filtrata con filtri HEPA , oppure all’interno di un glove box. Il “glovebox” consiste in un recipiente di plastica trasparente con 2 fori attraverso i quali infilare le mani nei guanti per manipolare gli oggetti sterili.

Esistono diversi modelli e modi per costruire un “glove box”, con una semplice ricerca sul tuo motore di ricerca sarai in grado di capire quale modello è più adatto alle tue esigenze.

Ogni volta che si utilizza il “glove box” è essenziale sterilizzare con alcol o una soluzione di ammoniaca. È possibile eseguire qualsiasi procedura utilizzando un “glovebox”, dalla clonazione di funghi, all’inoculo di “semi”, all’inoculo di substrati, alla manipolazione di terreni di coltura, piastre di Petri e molto altro.

Tutti i materiali e le superfici devono essere il più pulito possibile, ma quello che realmente fa la differenza sono comunque le correnti d’aria, quindi la tecnica. Sebbene sterilizzi il tuo glove box accuratamente, per rimanere tale non ci dovranno essere correnti d’aria che trasportano microrganismi. Quindi dopo averlo mosso e pulito, è sempre meglio aspettare almeno 30 minuti in modo che eventuali particelle rimaste al suo interno si depositino, prima di iniziare le operazioni.

Il consiglio è quello di utilizzare una sorta di griglia sollevata dove tenere tutti gli oggetti, tenendoli sospesi dal fondo del tuo “glove box” e quindi lontani dalle spore che si possono essere depositate per gravità. Seguendo questi suggerimenti e muovendoti rapidamente con precisione, sarai in grado di utilizzare il “glove box” evitando contaminazioni o riducendole comunque ad una percentuale accettabile.

Produzione di “seme” utilizzando grani colonizzati

Una volta che disponi già di un barattolo di substrato colonizzato al 100%, lo potrai usare per inoculare altri barattoli con i cereali appena sterilizzati. Questa tecnica è chiamata in inglese “grain to grain“, ed è un’ottima risorsa per moltiplicare rapidamente esponenzialmente la quantità di “seme”.

La colonia iniziale che è stata inoculata direttamente con una coltura liquida o un pezzo di terreno di coltura colonizzato è chiamato matrice primaria. La matrice primaria contenuta in un barattolo può essere dunque smistata e usata per colonizzare altri 10 barattoli. Questi 10 barattoli possono essere usati per colonizzare altri 100 e il processo può andare avanti all’infinito contaminazioni permettendo.

Incubazione dello “spawn”

Dopo l’inoculazione, il “seme” deve essere incubato. L’incubazione è un processo molto importante nella coltivazione dei funghi e consiste essenzialmente nel fornire le condizioni ideali affinché il micelio colonizzi il substrato in cui si trova. L’incubazione è il passaggio successivo all’inoculazione. La luce e l’umidità non sono così importanti in questa fase, poiché i contenitori sono sigillati e mantengono l’umidità al loro interno. La temperaturainvece deve rimanere costante tra valori compresi tra i 20 e 25 °C.

Durante l’incubazione è consigliato controllare regolarmente i barattoli evitando di scuoterli per non rompere le ife che stanno crescendo . Questo controllo quotidiano permette di monitorare lo sviluppo del micelio e l’eventuale comparsa di contaminazioni. Al minimo segno di contaminazione dovrai scartare e provvedere ad eliminare il contenuto lontano dal luogo di lavoro.

Alcune muffe e batteri possono essere dannosi per la nostra salute oltre che per il micelio, quindi prestate la dovuta attenzione se dovrete maneggiarli ed eliminarli. Le contaminazioni più comuni in questa fase sono causate da muffe Penicillium e Aspergillus, e batteri che rendono il grano marcescente e viscido. Bisogna scartare qualsiasi materiale che odori di rancido. Di solito in caso di contaminazione l’odore è pungente e non lascierà dubbi.

Il micelio ha un colore comunque biancastro, ogni altro colore (macchie verdi, azzurre, arancioni e nere) è indicativo di contaminazione e deve suonare come un campanello d’allarme.

Incubazione dei “semi”

L’incubatrice può essere realizzata in diversi modi, in scatole di cartone, polistirolo, frigoriferi spenti o stanze intere. La temperatura all’interno dell’incubatrice deve essere mantenuta costante; lampade ad incandescenza, riscaldatori per acquari (per incubatori di piccole dimensioni) e riscaldatori per ambienti (nel caso l’ambiente fosse più grande) possono essere utilizzati.

Sappi che le incubatrici realizzate con contenitori chiusi devono essere aperte quotidianamente per rinnovare l’aria. I barattoli hanno dei filtri in modo che il CO2 in eccesso prodotto dal fungo fuoriesca. Se il CO2 che fuoriesce dai barattoli si concentra all’interno dell’incubatore, non vi sarà nessun ricambio d’aria.

Conservazione del “seme”

Una volta colonizzato, il “seme” può essere conservato per un breve periodo di tempo prima che si verifichi un calo della vitalità. Con l’invecchiamento del “seme”, i nutrienti contenuti nei chicchi si esauriscono rallentando il tasso di crescita del fungo. Perdendo quindi in vitalità, il micelio perde anche gradualmente la sua capacità di difendersi da eventuali contaminazioni.

Un “seme” si conserva in condizioni ottimale per 30 giorni, dopodiché inizierà a perdere rapidamente la sua vitalità. Tuttavia, se non si intende utilizzarlo a breve, lo si può conservare in frigorifero. Il “seme” può essere refrigerato per alcuni mesi ad una temperatura mai inferiore a 4 °C (anche questo dipende nello specifico dalla specie che coltiviamo). Questo passaggio consentirà di rallentarne il metabolismo e la crescita, estendendone la conservazione.